摘要
数字 PCR( digital PCR， dPCＲ) 技术被认为是精确定量核酸分子的全新技术手段， 因为具有较高的灵敏度和特异性等特点而得到迅速发展 ,为此我们采集了2018年5月10前PUBMED中的所有数据文献，文献类型包括综述和原著，应用（Data Sources: This review was based on articles published in PubMed databases up to May 10, 2018( Study Selection: Original articles and reviews on the topics were selected). with the following keywords） “数字PCR ”“ 优势”, “对接”, and “微流控芯片，妇科肿瘤”等关健词检索.结果显示数字 PCR 在临床上的多个领域展现出良好的应用前景， 比如肿瘤液体活检，无创产前筛查， 某些病原微生物分子诊断以及二代测序文库质控和结果验证等。本文就数字 PCＲ 在上述领域中的应用研究及其进展进行综述。
关健词
数字PCR ； 优势；对接； 微流控芯片；妇科肿瘤
聚合酶链式 反 应 ( polymerase chain reaction， PCR) 至今 已从“第一代 PCＲ”发展到“第三代 PCR”。“第一代 PCR”通常采用凝胶电泳的方式分析 PCＲ 产物，存 在检测限过低、操作繁琐、适用于定性研究等局限; “第 二 代 PCＲ”是 实 时 荧 光 定 量 PCR ( real-time quantitative PCR，qPCR) ，其定量依赖标准曲线，有 耐受性差等缺点［1］;“第三代 PCR”是基于分割体系 的 绝 对 定 量 PCＲ，也 称 数 字 PCR ( digital PCR， dPCR) 。数字 PCR 技术已经在痕量核酸分子检测、 稀有突变体检测和拷贝数变异等方面展现出高灵敏 度和精确性等优势，在医学分子诊断领域具有良好 的应用前景[2].
1.数字PCR的历史与优势
1.1历史
1992年Sykes等[3］检 测 ＩｇＨ 重链突变基因时，采用了有限稀释和以终点信 号的有无进行定量的策略，形 成 了 数 字 PCR 的雏 形。1999 年 Kenneth KZ 和 Bert VS［4］在检测大肠癌患者 K-RAS突变时，对样 品 采 用 有限稀释并增加了反应室的数目，这种方法有效排 除了体细胞干扰，成功检出微量 K-RAS突变，进一 步提出了数字PCR 的概念。但是该方法 需 要 人 工 稀释 DNA样本，操作步骤繁杂且实验误差较大。2003年 Liu等在此基础上提出微流体概念，通过 微泵微阀对 DNA模板进行自动分液，提 高了 样 本 稀释精确度，降 低 了 操 作 误 差，但 由 于 芯 片 需 要 定 制，成本高昂［5］。直 到2011年，Quantalife公司 基 于 油包水微滴生成技术研发出微滴式数字 PCR，其具 有高 通 量、自动化、低 成本等优点，促进了数字化 PCR走向临床应用.
1.2数字 PCR 的基本原理
数字 PCR( dPCR) 是将含有核酸分子的 PCR反应体系“分割”成数量众多的、纳升级的反应单元，核酸分子在每个反应单元中随机分布，每个反应单 元中包含 0、1 或者多个目标核酸分子; 然后进行 PCR 扩增反应; PCR 扩增结束后，对每个反应单元 的荧光信号进行计数统计和分析［6］。有荧光信号 的反应单元判读为 1，没有荧光信号的判读为0，最终根据泊松分布原理及阳性反应单元的个数与比 例，计算出目标 DNA 分子的起始拷贝数浓度。理论 上，在目标 DNA 分子浓度极低、分割形成的反应单元数量足够多时，每个反应单元只含有 0 或者 1 个 目标分子，则有荧光信号的反应单元数目等于目标 DNA 分子的拷贝数; 但是通常情况下，每个反应单元可能包含2个或者 2个以上的目标分子，所以数 字 PCＲ 的数据处理需要采用泊松分布公式进行校 正和计算。
1.3数字 PCR 的优势
1.3.1样本需求量低
数字PCR 检测所需样本量低，在检测珍贵样本或者样本核酸存在降解时，数字PCR优势明显。目前，很多基因组研究方法，例如，比较基因组杂交（ Comparative genomic hybridization,CGH）芯片、二代测序（Nexx generation sequencing,NGS）等，需要对有限的临床样本进行扩增，以保证达到实验样本量的要求。而数字PCR所需样本量低，避免预扩增带入的误差，使结果更加可靠。[7]
1.3.2数字PCR的高灵敏度和绝对定量
与传统荧光定量PCR技术相比，数字PCR的灵敏度高，更适合常规临床使用。数字PCR 原理是将标准PCR反应体系分配至大量微小的反应单元中，这能大大提高PCR反应体系对抑制物的耐受能力。传统的扩增技术的灵敏度只有1%，但数字PCR可轻松实现但分子检测，灵敏度可达0.1%，甚至0.001%。这对于临床上痕量核酸标本检测，复杂背景下稀有突变检测，尤其是循环肿瘤DNA检测特别适用。随着检测技术的发展，现有的数字PCR检测平台的工作操作流程相对简单，兼容性强，且二维的结果图能更直观地读取数据[8]。
1.3.3数字PCR的不受扩增效率影响和结果具有高重复性
数字PCR还可以实现绝对定量，突变扩增阻滞系统（ARMS）技术只能得到定性结果，传统的绝对或相对定量的PCR分析结果高度依赖于标准曲线或者内参基因，无法做到精准绝对定理。数字PCR在结果判读进仅判断“有/无”两种扩增状态，通过直接计数或泊松分布来进行定量分析，实现了真正意义上的绝对定量[9]。
1.3.4数字PCR可以与新一代基因测序对接
在PCR过程中影响扩增效率的因素众多，比如酶、引物水平，PCR抑制物等，不能保证其定量分析所依赖的基础---循环阈值（Ct）的恒定性，使得相同实验不同次重复检测结果的重现性较差，甚至可能会得到完全相反的结果。与荧光定量PCR不同的是，数字PCR通过终点荧光信号计算浓度，不依赖Ct值，因此不受扩增效率的影响，能够将误 差控制在5%以内，实现检测结果的高度重复性。数字PCR在减少使用通用引物或探针设计在多样性靶序列导致错配方面也具有优势。数字PCR平台可以与新一代基因测序技术（NGS）对接，实现对测序文库的定量分析和质量评估信息。一方面，数字PCR对NGS的测序结果进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包括反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段，过长连接片段等，这是当前其它方法所不具备的优势[10]。
2 数字PCR流程与基本装置
根据反应混合液的分割方式不同，数字 PCＲ 主要分为2 大类: 微流控芯片式数字 PCR( chip digitalPCR，cdPCR) 和微滴式数字 PCＲ ( droplet digital RCR， ddPCR) 。
2.1 微流控芯片式数字 PCＲ
微流控芯片数字 PCR( cdPCR)是通过微流控技术， 将反应液均匀导入到芯片微池或者通孔中进行PCＲ 反应， 反应结束后用荧光成像仪或者荧光倒置显微镜检测荧光结果。然后，用图像处理软件分析，最终得到目标序列拷贝数。芯片类型有集成微泵阀式芯片、 阵列微池式芯片和滑片式芯片。集成微泵阀式芯片是以聚二甲基硅氧烷芯片( polydimethylsiloxane， PDMS) 为材料， 采用多层软刻蚀技术( multilayer soft lithography， MSL) 加工， 将微流控通道、 阀门和反应仓集成在一张芯片上， 通过精确地控制微泵阀的开启与关闭， 可迅速将反应液分配到若干独立反应单元［14］。阵列微池式芯片是在芯片上刻蚀微池阵列， 反应液由进样孔直接分配进入各反应微池［15］。滑片式芯片具有上下两片玻璃芯片， 滑动芯片可以把样本溶液从流体通道分配到含有反应单元的玻璃芯片上［16］。芯片式数字 PCR 有生成微滴体积均一、 避免管道造成的样本损失、 结果稳定等优点。商业化芯片式 PCR 有 BioMark 、QuantStudio3D 和Starry sky 10k三种系统。BioMark 系统采用集成微泵阀式芯片， 每张芯片上集成有相互独立的 1 万 ～ 4 万 个 反 应 仓;QuantStudio3D 系统采用阵列微池式芯片， 每张芯片上集成有 2 万个通孔［17］。Starry sky 10k系统采用的是八联管内置芯片技术，为数字PCR的分析提供了无以伦比的速度和简便。独一无二的管内芯片 ( chip-in-a-tube )设计在确保操作简便的同时又能形成稳定的分区。每一份PCR反应液均可在管内高密度芯片中快速形成10,000个稳定的分区。典型商业化芯片式数字PCＲ 工作流程如Fig1。
2. 2 微滴式数字 PCR
微滴式数字PCR( ddPCR) 采用油包水乳化微滴技术与微流体技术对样品进行微滴化处理。先用微滴发生器将样本中核酸分子随机分配到大量独立的油包水微滴中， 每个微滴均进行独立的 PCR 反应，然后， 用双光路检测系统逐个读取和分析每个微滴的荧光信号。微滴发生芯片有十字形、 T 形、Y 形［18-20］等多种微通道结构。典型的商业化微滴式数字 PCＲ 工作流程如 Fig． 2 所示。微滴式数字 PCR 的微滴发生卡大多只有一层结构， 加工尺度在微米级， 比芯片式数字 PCＲ 成本低， 但是存在微滴生成大小不均一的问题。所以， 商业化微滴式数字 PCR 采取了标准化措施， 即在生成的总微滴中挑选大小均一的微滴进行荧光信号读取， 然后， 再用泊松分布公式进行校正和计算。商业化微滴式数字 PCＲ 主要有 QX100 /200 和 Rain Dro系统 QX100 /200 系统可将每份反应体系分割成 2万个微滴， Rain Drop 系统可以分割生成 100 万至1 000万个微滴的反应乳液［21］.HU Si-Hong，et al. The Principle of Digital PCR and Its Applications in Current Molecular Diagnosis[7].
HU Si-Hong et al.The Principle of Digital PCＲ and Its Applications in Current Molecular Diagnosis[7]
3 数字 PCＲ 的应用
前述数字 PCR 的优势的章节中已经大部份提到了数字PCR的优势，数字PCR尤其适用于临床低丰度核酸分子的检测和定量，例如：（1）无创产前诊断 （2）相应肿瘤方面的应用（本文中所述为妇科肿瘤）。（3）标要中病原体检测，比如HIV等检测[11-13].
3.1 无创产前诊断
产前检查是减少出生缺陷二级预防措施的重要 手段。传统的产前诊断采用羊水穿刺和绒毛取样等 侵入性取样方式，存在一定致流产机率。1997 年发 现，母体血浆中存在胎儿游离 DNA( cell-free fetal DNA，cffDNA ) ，研究者们开始无创产前诊断 ( noninvasive prenatal testing，NIPT) 的研究热潮［22］。胎儿游离 DNA 在母体血浆中含量非常少。有研究 表示，胎儿游离 DNA 在母体血浆 DNA 占 10% - 20%［23］，极低的胎儿游离 DNA 含量混杂于大量母 体 DNA 中，这需要高灵敏度的分子诊断技术。dPCＲ 为无创产前诊断提供了新的技术思路和手段。只需克服母体血浆 DNA 背景的干扰，对其中含 量极低的胎儿游离 DNA 标记进行精确定量分析，即 可达到在基因水平对各种遗传疾病准确检测。染色 体非整倍体、单基因遗传病、常染色体隐性遗传病是产前诊断的重要内容。EI Khattabi 等［24］建立 dPCＲ 与水解探针结合来定量血浆循环 DNA 含量的方法， 以 213 名怀孕妇女的血浆 DNA 为材料进行研究。结果认为，dPCＲ 可以满足在无创产前诊断中对 21 三体综合征的筛查工作; Barrett 等［25］研究 dPCＲ 在 无创产前诊断中，检测镰状细胞性贫血症( sickle cell disease，SCD) 的可行性。结果显示，dPCＲ 检测 胎儿 Y 染色体特异标志物 DYS14，检出 82% 男性胎 儿及 75% 女性胎儿患有镰刀红细胞贫血。dPCＲ 技 术应用于无创产前诊断，准确性高于现行常规产前 筛查技术，有成为产前常规检测技术的巨大潜力（表1）.
3.2PCR在染色体非整倍体中的应用研究
无创产前基因诊断胎儿非整倍体疾病时，由于胎 儿游离 DNA 含量 低，检测结果准确性受到大量母 体背景DNA 影响，而数字PCR 直接计数目标分子 数，因 此 具 有 更 佳 的 稳 定 性 和 定 量 准 确 性。Fan 等［26］应用微流控芯片检测21－三体胎儿，通 过 对 比 21号染色体上淀粉样蛋白基因序列与１２号染色体 上磷酸甘油醛脱氢酶基因序列拷贝数的差异，准确 辨别出21－三体胎儿，甚至在胎儿 DNA 仅占血浆游 离 DNA 总浓度10％时也可检出，检测 敏 感 性 远 远 高于实时PCR 和荧光定量 PCR。Tong等［27］利用 母胎甲基化表达差异与数字 PCR结合的方法，采用 表观遗传物－染色 体 剂 量 法 检 测 男 性 胎 儿21－三体，以Ｙ染色体上ZFY基因表达量为内参，准确检测5例孕21－三体的孕妇血浆。Lo等［28］以稳定表达的１号染色体做参照，采用染色体相对定量方法 检测非整倍体。但实验中要求胎儿DNA 浓度占血 浆游离 DNA 总浓度的25％以上，由于孕妇 周血中胎儿游离 DNA 浓度 平 均 占6%-10%［29］，目前 尚无有效富集胎儿 DNA方法，不适用于临床推广。TSUI［30］使用数字RCR对单核苷酸多态性等位基 因及胎儿游离 DNA 中 PLAC4表达水平定量检测， 检出4例21－三体 胎 儿，灵 敏 度 达 到100％，特异 性 为89％，而该方法只能用于检测杂合子SNP位点。
3.3常染色体 隐性遗传病
2008年有文献［31-32］采 用相对突变剂量法和数字化核酸片段分选法相结合 的策略，首次应用数字 RCR 检测β－地中海贫血，在 双亲携带相同突变的情况下，通过定量母源性突变DNA 和胎儿突变DNA，对胎儿是否遗传致病基因 型进行确诊。2012年 Lam等［33］对相对突变剂量法 进行了改良，依据父源性的遗传单倍型，设计了针对 珠蛋白及其外部 SNP位点的探针来筛选可提供信 息位点，又根据母源性单倍型将 SNP分为α和β两 组，借助数字 PCR 技术推断胎儿基因型，成 功 分 析 了2个β地中海贫血家系。同年，Barrett等［34通过 数字 PCR检测胎儿 Ｙ 染 色 体 特 异 标 志 物DYS14，检出82％男性胎儿及75％女性胎儿患有镰刀红细 胞贫血，说明其精确的定量及高分辨率可解决母体 外周血中孕妇外周血胎儿游离 DNA 含量较低以及 高背景母体 DNA 的问题。Pornprasert等［35］设计了两对引物分别扩增野 生型α珠 蛋 白 基 因 和 ＳＥＡ 基因，通 过 微 滴 式 数 字 PCR定量分析，检出了15例 SEA 型地贫携带者和 ８例重度α地贫胎儿，证明了微滴式数字 PCR 在地 贫基因诊 断 中 的 有 效 性。WINSTONKOH 等［36］在诊 断甲基丙二酸血症时采用突变位点等位基因定量结 合游离DNA 中胎 儿 片 段 检 测 法，在 阴 性 对 照 中 识 别出１１个阳性标记，由此推断胎儿是否遗传有由父 母携带的突变基因。该方法不受性别限制，无需大 量样本分析，可用于分析已知突变（表1）。TSUI等［37］通过使用数字 PCR检测 Ｘ染色体上的基因位点，经过相对诱变剂 量法分析，在12个样本中准确地识别出7个含有血 友病突变基因的男性胎儿。在此实验中，胎儿的基 因型最早可在孕11周测定，充分展示了该方法在早期诊断中的潜力
4 妇科肿瘤的应用
ddPCR技术是一种通量较高、成本较低的绝对定量技术，可作为HER2基因扩增状态的初筛技术。该技术与传统方法的检测结果符合率高，两种方法一致性好。ddPCR技术可应用于浸润性乳腺癌HER2基因检测，可得到HER2基因的绝对拷贝数，检测精度高，成本较低，是其他半定量技术、第二代测序、芯片杂交平台无法比拟的。结果显示ddPCR检测与IHC联合FISH检测的阳性结果一致率为93.9%（31/33），阴性一致率为100.0%（77/77）。HER2基因扩增与ER、PR阴性状态、Ki-67高表达、组织分级高等不良预后有关，提示ddPCR检测指标绝对值越大，肿瘤的恶性程度越高，患者预后越差。当每细胞平均拷贝数大于3.2时，结合激素受体表达情况，提示患者可使用针对HER2的靶向药物联合内分泌治疗[38].
4.1 ddPCR在不同乳腺癌亚型中的应用
4.1 激素受体阳性乳腺癌
目前，约 2/3 的浸润性乳腺癌为 Luminal A 或 B 型，即激素受体（hormone receptor，HR）阳性乳腺癌， ddPCR在这两型乳腺癌中的研究主要是围绕内分泌 治疗（endocrine therapy，ET）的耐药问题，缺乏独立分 型研究，故本文以 HR 阳性乳腺癌进行论述。在 HR 阳性转移性乳腺癌中，虽然ET为一线治疗［39］ ，但是在 反复的ET中肿瘤均产生了对雌激素的抵抗力，变成 非激素依赖型。近年来，雌激素受体 1（estrogen re⁃ ceptor 1，ESR1）激活突变是研究的热点。通过 NGS 技术，发现ESR1突变的富集区在537号酪氨酸和538 号天冬氨酸，即ESR1 Y537S、Y537N、Y537C、D538G， 涵盖 80%以上 ESR1 突变，并与 ET 抵抗相关［40-41］ 。为 将这些发现的突变位点作为一种ET抵抗的生物标志 物，应在疾病进展时同步进行ESR1基因型分析，cfD⁃ NA分析就是为克服组织活检不便而建立的方法。为了在极少量的 cfDNA 中获取 ESR1 突变频率并证明 其临床作用价值，在10%～30%ET耐药的HR阳性转 移性乳腺癌中，应用 NGS 技术确认 ESR1-LBD 基因 出现突变富集［42-43］（表1）.在原发性乳腺肿瘤（primary breast tumor，PBT）中普遍认为ESR1突变频率非常低.ddPCR 同样适用于在 cfDNA 中检测 HER-2 的 CNVs。Gevensleben 等［44］选择1.25作为cut-off值，结果显示在11例FISH及IHC确认的HER-2阳性样本 中，ddPCR检出的HER-2阳性率为64%（7/11），在47 例FISH及IHC确认的HER-2阴性样本中，ddPCR检 出的 HER-2 阴性率为 94%（44/47）。其中 FISH 及 IHC检测的组织均源于PBT，3个假阳性结果的分析 显示可能是因参照基因少量的丢失，或这些患者肿瘤发生转移后真的获得了HER-2的扩增；3个假阴性 结果的分析表明这种不一致性可能反映了基因组 HER-2状态的改变，因所有假阴性结果的患者在肿瘤发生转移后均接受过抗HER-2治疗，可能导致肿 瘤内部异质性的选择而变成非HER-2扩增型。Gar⁃ cia-Murillas等［45］ 选择2.0为cut-off值，结果显示在18 例FISH及IHC确认的HER-2阳性样本中，ddPCR检 出的HER-2阳性率为100%（18/18），在58例FISH及 IHC确认的HER-2阴性样本中，ddPCR检出的HER-2 阴性率为98%（57/58），敏感性和特异性分别为100% 和98％。应用ddPCR对HER-2的CNVs开展精准检 测，理论依据充分，为下一步临床应用奠定了基础。近期一项关于胃癌的 HER-2 研究中［46］ ，采用 ddPCR 对 cfDNA 中 HER-2 状态进行持续监测，揭示术前、术后或复发时HER-2状态的变化。提示曲妥 珠单抗的治疗或具有时间和空间异质性，在治疗的 过程中或因遗传分化伴随着肿瘤衍变，亦或化疗引 起肿瘤内部异质性的选择，造成HER-2状态的改变， 从而影响临床治疗决策。应用ddPCR对乳腺癌围手术期、化疗或转移前后HER-2状态进行持续监测值 得借鉴。
4.2 三阴性乳腺癌
三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TN⁃ BC）TNBC 是一种高度异质 性的肿瘤，目前分子病理和基因表达谱是识别TNBC 亚型、寻找新的治疗靶点以及发现体细胞基因突变 的公认方式［47-48］。PIK3CA是近年来致癌基因的研究热点，编码磷脂 酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinases，PI3Ks）信 号通路中的p110复合物。在乳腺癌中PIK3CA突变占 20%～40％［49］ ，是继TP53基因之后第二常见的突变基 因。一项Meta分析表明，PIK3CA突变的临床意义依据 不同的乳腺癌表面受体类型而不同［50］。临床上已证实， PIK3CA突变本身对于HR阳性乳腺癌患者预后价值有 限［51］ ，但在TNBC中关于PIK3CA突变的临床意义鲜有 报道。现已证实在 TNBC 中雄激素受体（AR）与 PI3Ks 信号通路相关，包括 PIK3CA 突变［52］ ，但 AR 表达与 TNBC 预后关系尚存争议。因此，在 TNBC 中检测 PIK3CA突变对其预后以及对AR信号通路的影响具 有重要意义（表1）。Takeshita等［53］ 应用ddPCR首先对49例 血液样本及 42 例相对应的肿瘤组织样本中 PIK3CA 突变频率进行分析，结果显示二者之间并不相关，但 这并不有损 ddPCR 的准确性。原因为：1）2）研究结果反映日益凸显的肿瘤异质 性问题，ESR1突变频率在cfDNA中与肿瘤组织中的 检测结果不同，可能是由肿瘤异质性所引起［54-56］。4.3近期，董周寰在2018年文献中建立数字 PCR（ddPCR）法检测乳腺癌,用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片样品中人表皮生长因子受 体2（HER2）的拷贝数变化（CNV），并与免疫组化（IHC）、荧光原位杂交（FISH）结果比较，单、双通道法对HER2 CNV检测结果一致；细胞及临床样品检测结果表明，ddPCR检测 HER2 CNV的阴性、阳性 Cut-off值分别为 1.2、2.1，中间值为 1.2-2.1。14例 FISH阴性标本中，ddPCR 的一致性为93%（13/14）；3例IHC“+++”的样品中，FISH检测均为阳性，2例ddPCR检测为阳性，1例（17#）检测临界阳 性。2例IHC“++”的样品，FISH检测阳性，但ddPCR检测为阴性[57]。
4.结论与展望
总之，数字PCR技术是通过单分子 扩增降低了背景 DNA 的影响，极大提高了阳性反应中的信噪比，具 有超高灵敏度，可用于低 浓 度 DNA 的检 测［58］。但 作为一项新兴技术，数字 PCR 仍存在一 些问题，数字PCR每个反应的限的标本体积限制了分析的检测下限，由于有限数量的分区限制了小动态范围，分区中并非所有模版均被扩增，任何时候均可能出现分子断流导致假性低量化，这在定量RNA时尤其突出，某些RNA靶点逆转录可能不完整，标本中并非所有拷贝均被检测到。
此外，对于较大的扩增子数字PCR尚不能准确量化。标本吞吐量较低，污染风险高均是数字PCR面临的主要问题。目前，大多数数字PCR仪器只能测量两种荧光，限制了同一样品中不同目标的多重检测能力。如果数字PCR的具体应用需要纳入内部控制，则可能需要基于不同染料浓度或染料混合物的更复杂的多重策略。数字PCR平台反应液的选择仍受商业仪器的限制，不同厂家试剂和平台的结果尚存大差异[59]。再如密仪器和复杂芯片的微流体数字PCR成本高昂，通量低；微滴式数字 PCR 检测极低拷贝数样本时其检测结果不稳定，需要多次平行实验，而且数字PCR 检测胎儿染色体异常及单基因病尚未建立成熟方法学，需要更多的病例进行验证。
我们期望未来几年该技术不断发展完善，在产前诊断及其她产科领域发发挥更大的作用。
